La cromatografía líquida renovada mejora el análisis de vitaminas

Las vitaminas desempeñan un rol esencial en la regulación de procesos fisiológicos clave, como la coagulación de la sangre, metabolismo y mantenimiento de la visión. Estos compuestos biológicamente importantes se pueden dividir en dos grandes clases según su solubilidad y difieren en la forma en que se manipulan en el cuerpo y en laboratorios de inocuidad alimentaria. Si bien se excretan cantidades excesivas de vitaminas solubles en agua (incluidas B1, B2, B3, B6 y B12), las vitaminas solubles en grasa (incluidas las vitaminas A, D, E y K) se pueden almacenar en el hígado o tejido graso para su uso posterior. El análisis simultáneo de vitaminas solubles en agua y en grasa en la cromatografía líquida tradicional es difícil y se ve agravado por la presencia de isómeros vitamínicos biológicamente importantes, que existen en concentraciones más bajas y exigen una mayor sensibilidad de las técnicas analíticas.

Los laboratorios de análisis de alimentos apoyan a los fabricantes de alimentos mediante la evaluación de seguridad y autenticidad de los alimentos y tienen la responsabilidad de producir datos precisos y confiables. Las vitaminas se encuentran entre una serie de compuestos evaluados en fórmulas infantiles, bebidas energéticas y otros suplementos, así como también se agregan para fortalecer el valor nutricional de estos productos. Dado el papel nutricional crítico de las vitaminas, especialmente durante los primeros períodos de desarrollo, su caracterización es muy importante. Esto, junto con la naturaleza desafiante y engorrosa del análisis de vitaminas, ha estimulado el desarrollo de métodos innovadores de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para las pruebas de inocuidad alimentaria.

Desafíos únicos del análisis de vitaminas

El análisis simultáneo de vitaminas solubles en agua y en grasa es difícil de lograr con la cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa, debido a la amplia gama de hidrofobicidad entre las vitaminas. Las vitaminas liposolubles altamente hidrófobas se retienen fuertemente por columnas de cromatografía y solo se eluyen con fases móviles de alta resistencia. Por el contrario, las vitaminas solubles en agua generalmente se retienen mal, incluso con fases móviles muy débiles. Como las condiciones ideales para la separación cromatográfica son muy diferentes para las dos clases de vitaminas, se han realizado esfuerzos para explorar la posibilidad de operar dos columnas secuencialmente en un sistema. Sin embargo, las primeras versiones de este enfoque no eran adecuadas para los laboratorios de seguridad alimentaria de alto rendimiento, lo que requería una configuración de hardware compleja y una programación del sistema de datos cromatográficos aún más complicada.

Antes del análisis por cromatografía líquida, las muestras de alimentos deben purificarse y concentrarse para garantizar que los analitos objetivo se puedan detectar sin interferencia de la matriz. La extracción líquido-líquido es un método de purificación utilizado para preparar el análisis de vitaminas y otros compuestos; fue uno de los primeros métodos desarrollados para la purificación y permite separar los compuestos en función de sus solubilidades relativas en dos líquidos inmiscibles diferentes. Es un método simple, flexible y asequible, pero tiene varias desventajas importantes. La extracción líquido-líquido consiste en de múltiples pasos tediosos y requiere el uso de grandes volúmenes, por tanto, el tiempo de finalización depende en gran medida de las habilidades y la experiencia del operador. En consecuencia, la duración de la exposición de la muestra a condiciones desfavorables puede variar mucho, lo que compromete la reproducibilidad y la eficacia del método. Esto es motivo de preocupación para las vitaminas que son particularmente propensas a degradarse y perder cuando se exponen al calor y la luz, como la vitamina D en la leche en polvo.

La cromatografía líquida bidimensional permite un análisis más profundo y rápido

Los analistas de la industria de alimentos están bajo presión para procesar grandes volúmenes de muestras y requieren sistemas simples, de alto rendimiento y alta resolución. Afortunadamente, los sistemas de cromatografía líquida bidimensional (2D-LC) han evolucionado notablemente en los últimos años y son ideales para la separación de vitaminas, así como también en otros compuestos en alimentos y bebidas. Hay dos tipos principales de sistemas, conocidos como 2D-LC completos y rompedores. En 2D-LC integral, la muestra se separa en la primera columna, como estaría en 1D-LC. Luego, todo el eluido se pasa en distintas porciones a una segunda columna con una selectividad diferente, lo que permite una separación mejorada de los compuestos que eluyen estrechamente. Por el contrario, la LC 2D de corte de corazón es más adecuada para estudios dirigidos, porque sólo una fracción seleccionada (corte de corazón) del eluato se transfiere a la columna de segunda dimensión.

Hace unos meses surgió otro enfoque novedoso que utiliza dos caminos de flujo LC independientes. En los flujos de trabajo duales, cada muestra es procesada por dos columnas en paralelo, que están integradas en un solo instrumento para facilitar su uso. Las columnas pueden ofrecer análisis idénticos o diferentes para permitir un mayor rendimiento o conocimientos más profundos sobre cada muestra. Este enfoque es muy adecuado para el análisis de vitaminas, ya que las dos columnas de fase inversa permiten el análisis simultáneo de vitaminas solubles en agua y grasas. Se requiere un método de preparación simple y optimizado para cada una de las dos clases de vitaminas para garantizar que las muestras se filtren y concentren o diluyan adecuadamente, de acuerdo con la cantidad esperada de analito en la muestra. El enfoque dual permite evaluar una amplia gama de ingredientes al mismo tiempo en tabletas de suplementos, bebidas energéticas y otros alimentos, además de bebidas que contienen vitaminas solubles en agua y en grasa. Para los analistas que trabajan para validar las afirmaciones de los vendedores de alimentos, estos avances son un cambio bienvenido.

Los métodos refinados de detección y extracción crean un impulso en la productividad

Los analistas de los laboratorios que estudian los alimentos ahora tienen una mejor capacidad para detectar una amplia gama de componentes en menos tiempo, debido a los métodos mejorados de detección y extracción. Los sistemas LC modernos utilizan una amplia gama de detectores analíticos, que incluyen:

  • Espectrometría de masas (MS)
  • Detección de matriz de diodos (DAD)
  • Detección de longitud de onda múltiple
  • Detección de aerosoles cargados (CAD)
  • Detección de fluorescencia (FLD)

La tecnología de detector óptima dependerá de las características moleculares del analito objetivo. La fórmula infantil, por ejemplo, puede ser analizada por DAD y FLD, con una detección y separación lo suficientemente poderosas como para cuantificar con precisión los cuatro isómeros de la vitamina E y separar la vitamina D2 y D3. Los métodos de LC 2D de alta sensibilidad también son particularmente favorables para la cuantificación del nivel de trazas de toxinas en los alimentos, como las aflatoxinas en nueces, granos y especias.

Dadas las limitaciones de la extracción líquido-líquido, se ha buscado un enfoque alternativo y simplificado para el análisis 2D-LC. La extracción líquido-líquido, antes del análisis por cromatografía, considera muchos pasos de separación tediosos. Por el contrario, el uso de la extracción en fase sólida para las pruebas de fórmulas infantiles reduce el tiempo de pretratamiento de tres horas a una hora, al tiempo que mejora la detección. Esto es de gran importancia en el contexto del control de calidad del producto empresarial, donde un método de pretratamiento más rápido y simple se traduce en una mayor capacidad de prueba y evaluación del producto.

El kit de herramientas de HPLC para análisis de seguridad alimentaria continúa expandiéndose

También se han utilizado varios otros enfoques de HPLC en el campo de la inocuidad de alimentos y la autenticación. Por ejemplo, la cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (UHPLC) con detección por CAD seguida de análisis de componentes principales (PCA) se puede utilizar para investigar la pureza del aceite de oliva. A diferencia de los enfoques convencionales (análisis de ácidos grasos y esteroles), este método revisado requiere muy poco tiempo y recursos de laboratorio para completarse, lo que permite a las empresas reducir significativamente los costos mediante la implementación de análisis de pureza internos. Con una menor necesidad de productos químicos y disolventes en comparación con los análisis de ácidos grasos y esteroles, UHPLC-CAD proporciona una alternativa más ecológica.

El análisis del contenido de aminoácidos en el vino es un aspecto importante del control de calidad, pero requiere derivatización para mejorar la retención y separación de aminoácidos altamente hidrofílicos. La derivatización, sin embargo, es laboriosa, propensa a errores e implica el manejo de productos químicos tóxicos. Para superar estas limitaciones, la cromatografía líquida de interacción hidrófila (HILIC) combinada con la detección de masas se ha identificado como un método alternativo. Si bien HILIC es una técnica eficaz para la separación de pequeños compuestos polares en fases estacionarias polares, aún puede haber casos en los que los analitos en muestras complejas no se separen completamente. La combinación de HILIC con la detección de EM supera este desafío, porque la EM proporciona otro nivel de selectividad. Los detectores de masa modernos de un solo cuadrupolo son fáciles de operar y controlar, por lo que incluso los usuarios sin experiencia en MS profunda pueden disfrutar de una precisión y reproducibilidad mejoradas, mientras se saltan los pasos de derivatización.

Conclusión

Las innovaciones recientes en la tecnología LC 2D y dual se adaptan bien al análisis rutinario de vitaminas y la evaluación de otros componentes importantes en la evaluación de la inocuidad alimentaria. La evaluación simultánea y precisa de las vitaminas solubles en agua y en grasa, a pesar de sus características de elución y retención marcadamente diferentes, es un gran paso adelante para la industria. Las mejoras drásticas en la usabilidad, flexibilidad y sensibilidad de 2D-LC también permiten detectar isómeros de vitaminas biológicamente importantes a niveles de trazas. Un cambio hacia sistemas más simples y de alto rendimiento que eliminan los complicados procesos de ensamblaje, la derivatización y la extracción líquido-líquido ahorra tiempo y dinero, al tiempo que permite a los laboratorios producir resultados más confiables para los fabricantes de alimentos. En términos de ahorro de tiempo y solventes, la extracción en fase sólida es superior a la extracción líquido-líquido y es una de las muchas adiciones bienvenidas al conjunto de herramientas de análisis de alimentos.

Noticia publicada con información de Food Safety Tech

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